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一文看懂顯微注射法的原理及應(yīng)用

更新時(shí)間:2023-02-16   點(diǎn)擊次數(shù):2307次

將外源基因?qū)氚屑?xì)胞的方法有很多,其中一種比較普適、成功率又比較高的方法為顯微注射法。


首先,我們說說這種方法的原理:顯微注射法即是利用管尖極細(xì)(0.10.5μm)的玻璃微量注射針,將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中,然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi),實(shí)現(xiàn)宿主細(xì)胞的基因改造。

一般的動(dòng)物細(xì)胞,直徑大約10微米左右;人類真核細(xì)胞直徑范圍在:330微米,其中人卵細(xì)胞直徑約為100微米。故直徑為0.2微米的顯微注射器針頭可以為各種類型和任意大小的動(dòng)物細(xì)胞提供精準(zhǔn)的、重復(fù)性良好的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞旁注射。在注射的過程中,動(dòng)物細(xì)胞膜也會(huì)被刺破。但因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞膜良好的彈性和流動(dòng)性,在細(xì)胞膜被刺破以及細(xì)胞內(nèi)注入或者抽取點(diǎn)物質(zhì)之后,細(xì)胞膜還是可以恢復(fù)完整的,恢復(fù)好的細(xì)胞可以繼續(xù)存活,正常生長。當(dāng)然操作手法也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的成功率,針對不同細(xì)胞的操作手法方面的研究,現(xiàn)在也有很多文章發(fā)表出來。


顯微注射技術(shù)的長處為:任何DNA在原則上均可傳入任何種類的動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),對于所轉(zhuǎn)的外源基因沒有長度上的限制,目前已證明數(shù)百kbDNA片段均可以成功轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并整合進(jìn)其染色體組。操作過程如圖所示:



接下來,我們再說說顯微注射器針頭的制作:顯微注射過程中使用的微量移液管是用微電極拉制儀來制作的,先將玻璃毛細(xì)管加熱到其熔化的溫度,再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形,微量移液管小頭的直徑(小至0.2微米)與纖維操縱器的高精度相關(guān),它可以用于精準(zhǔn)的移液。


     

    SUTTER微電極拉制儀P-000                                                日本NARISHIGE拉制儀PC-100



顯微注射器的結(jié)構(gòu)如下圖所示:




注射器中加好需要注射的樣品之后,通過運(yùn)用顯微注射儀(壓力注射)可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴入靶細(xì)胞中。



 

               日本NARISHIGE顯微注射儀IM-400    

                                       美國warner顯微注射儀PLI-100A



現(xiàn)在,我們來歸納一下顯微注射法的應(yīng)用


(一)顯微注射法可用來做轉(zhuǎn)基因動(dòng)物:顯微注射技術(shù)是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中,使外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組內(nèi),再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體動(dòng)物的孑宮內(nèi)發(fā)育,從而獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。顯微注射法是目前轉(zhuǎn)移效率基較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法,可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移;外源基因的長度不受限制可達(dá)100kb ;實(shí)驗(yàn)周期相對比較短。它的不足之處是 :導(dǎo)入外源基因整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)無法控制;常導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變,可造成動(dòng)物嚴(yán)重的生理缺陷。盡管如此,由于顯微注射技術(shù)直接對基因進(jìn)行操作,整合率較高,因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物極為重要的方法。


(二)顯微注射法在植物、動(dòng)物的細(xì)胞發(fā)育研究的應(yīng)用:將特定的分子探針及衍生的細(xì)胞間質(zhì)成分導(dǎo)入活體細(xì)胞,為研究控制細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制提供了新的視野。


(三)顯微注射法用于做克隆動(dòng)物:供體細(xì)胞的細(xì)胞核用顯微注射器移入卵母細(xì)胞后,在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下,發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點(diǎn)狀態(tài)。核重編程的過程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉,而在正常胚胎發(fā)育中表達(dá)的基因重新被激活的過程。

重編程有三種可能的結(jié)果:

1,供核基因組沒有進(jìn)行重編程,重構(gòu)胚很快死亡;

2,部分重編程,重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡 ;

3,重編程,產(chǎn)生正常的克隆動(dòng)物。


(四)顯微注射器可以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞提取:在不改變細(xì)胞生存環(huán)境的情況下,用顯微注射器對單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞提取??蓡为?dú)提取細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,或者同時(shí)提取提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。提取后細(xì)胞仍可存活。相比于傳統(tǒng)的裂解方式,用顯微注射器提取的樣本更為干凈,可以得到很好地電鏡圖像。


(五)顯微注射法可以實(shí)現(xiàn)更優(yōu)的CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染方式:顯微注射器能夠進(jìn)行高速、高效地將CRISPR-Cas復(fù)合物注入細(xì)胞,幫助您克服對于傳統(tǒng)方式極難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因編輯問題。


我們再介紹一下顯微注射法的具體操作過程,顯微注射實(shí)驗(yàn)的操作需要在顯微鏡下進(jìn)行,如圖所示:



(一)在注射針內(nèi)裝液:使用無菌的微量加樣器從微注射針的后部加入待注射樣品。


(二)注射針安裝和定位:

1, 將裝液后的針頭的游離端安在連接器上,然后旋緊連接器以固定針頭,再將其固定到微操作儀的托針管上。

2, 把載有待注射樣本的培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺上,用低倍物鏡對準(zhǔn)細(xì)胞調(diào)焦;

3, 移動(dòng)針頭并在顯微鏡下調(diào)整微操作儀,直到針頭的陰影在視野的中心上方;

4, 使用工作用放大倍數(shù),調(diào)準(zhǔn)細(xì)胞焦距,找到針尖。


(三)顯微注射:

1,使針尖對準(zhǔn)細(xì)胞的待注射部位(細(xì)胞與針尖在同一焦面上),旋轉(zhuǎn)推進(jìn)旋鈕,針刺入細(xì)胞內(nèi)(卵膜、細(xì)胞膜、核膜)。

2, 旋轉(zhuǎn)加樣旋鈕,將樣本加入,并離開細(xì)胞。

余下,就是將操作好的細(xì)胞放回好好培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)束。


顯微注射法的缺點(diǎn)是:實(shí)驗(yàn)所需的設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時(shí)間的練習(xí),以及每次只能注射有限的細(xì)胞。


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